利用CTAB法在多樣品組織研磨機(jī)上提取植物總DNA（以下內(nèi)容只是簡單介紹，詳細(xì)情況，可咨詢本公司，）
一、實(shí)驗(yàn)試劑：
1.CTAB抽提液：
2%（w/v）CTAB
100mmol/LTris-HCl（pH8.0）
20mmol/LEDTA（pH8.0）
1.4mol/LNaCl
抽提含多酚較多的植物材料時(shí)（比如木本植物），上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。
抽提液于室溫保存，可在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%（v/v）的β-巰基乙醇。
2、醋酸鈉：
3mol/LNaAc
用冰乙酸調(diào)pH值至4.8-5.2。
3、TE溶液：
4、其它：
無水乙醇，異丙醇，75％乙醇，酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），氯仿：異戊醇（24：1），β-巰基乙醇，重蒸水。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1.樣品研磨
1）取1g的樣品放入2mlepp管中
2）加入1-2粒5mm研磨珠
3）加入1ml的CTAB抽提液
4）將加有樣品的epp管放入多組織研磨儀的適配器中，蓋好
5）將研磨頻率調(diào)到60Hz，設(shè)定研磨時(shí)間為90秒（可根椐樣品的研磨的難易程度來調(diào)節(jié)，此數(shù)據(jù)是以銀杏落葉為樣本得出）
6）啟動(dòng)研磨儀對(duì)樣品進(jìn)行研磨（根據(jù)不同的樣品，本身性質(zhì)不同，需要對(duì)研磨頻率和研磨時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）
2.DNA的粗提
1）將研磨好的樣品取出于65℃水浴45min，中途間隔（輕柔）振蕩三次混勻
2）冷卻后加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕柔顛倒混勻使乳化10min
3）7000g-8000g離心10min（18-20℃）
4）吸取上清于另一干凈的離心管中
5）（根據(jù)需要可用氯仿：異戊醇如上法重復(fù)抽提一次，吸取上清）
6）加入與上清液等體積（且已于-20℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，約1至2分鐘后應(yīng)有白色絮狀沉淀出現(xiàn)（若沒有，則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,混勻，于－20℃冰箱中沉淀30min）
7）離心法沉淀DNA
8）在75%乙醇中漂洗DNA數(shù)分鐘以上，用Tip頭吸干乙醇
9）用1ml75%乙醇再漂洗一次
10）沉淀于室溫或64℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明，不要過度干燥
11）用50μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。
3.DNA的純化
1）向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μlRNaseA（約40-100μg）
2）于37℃酶解RNA1hr或65℃酶解RNA30min以上
3）加入50μl酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕輕顛倒混勻10min
4）10000g以上常溫離心10min，吸取上清
5）加入50μl仿氯：異戊醇（24：1）輕輕顛倒10min
6）10000g以上常溫離心10min，吸取上清（根據(jù)需要可重復(fù)用氯仿：異戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚）
7）向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇，于－20℃沉淀30min以上
8）12000g、4℃低溫離心10min,吸干液體
9）沉淀用75％乙醇漂洗二次
10）沉淀于室溫或64℃以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現(xiàn)半透明狀，勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶
11）取5μlDNA電泳檢查DNA的質(zhì)量
12）100-500倍稀釋后于分光光度計(jì)上測定OD260及OD280，分析DNA的濃度和質(zhì)量
13）保存DNA于-20℃
補(bǔ)充：如果需要提取的樣品比較多（比如1g），研磨好的樣品在后續(xù)的提取中，需要轉(zhuǎn)移到大的epp管中，研磨時(shí)可以加入較少的抽提液，研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補(bǔ)充抽提液，進(jìn)行后續(xù)的操作。
QQ交談
咨詢電話